溶酶体的离子通道

今天和大家分享溶酶体膜上的离子通道，主要内容来自徐浩新老师团队今年发表的综述。

Hu, M., et al. (2024). Physiological reviews, 104(3), 1335–1385.
摘要图：简要地展示了细胞内离子组成对细胞器和细胞生物过程的调节作用。以H离子和ca离子为例，pH梯度和钙离子（Ca²⁺）梯度在不同细胞器之间是有明显不同的。
Endomembrane System and Lysosomes

首先介绍一下内膜系统，内膜系统是细胞质中在结构与功能上相互联系的一系列膜性细胞器的总称。包括生物合成途径（内质网、高尔基体）,涉及蛋白质和脂质的合成、修饰、分选和运输。降解途径（早期内体、吞噬体、自噬体、晚期内体、溶酶体）主要负责维持细胞内稳态。
生物合成途径：蛋白质在内质网（ER）中合成后，经过折叠和修饰，通过运输小泡运送到高尔基体进行进一步加工和分选。在高尔基体中，蛋白质经历糖基化等修饰，并通过出芽形成分泌小泡/颗粒，运送到细胞膜或溶酶体等目的地。
降解途径： 通过吞噬作用形成的吞噬体与溶酶体融合成吞噬溶酶体；通过自噬作用形成的自噬体与溶酶体融合成自噬溶酶体此外；及通过内吞作用形成的内吞囊泡，发展早期内体（Early endosomes）融合，然后成熟为晚期内体（Late endosomes），最终发展成内溶酶体，然后利用水解酶降解细胞内外的物质，并通过溶酶体胞吐排出细胞。这些过程共同确保细胞内物质的更新和细胞器功能的维持。
值得注意的是，内膜上存在大（>3 倍）离子梯度，大多数内膜细胞器的 Na+、K+、 Ca2+和 Cl− 都存在梯度。而且，内膜细胞器是细胞内的 Ca2+ 储存中心。 和胞质相比Ca2+梯度可高达 5,000 倍。每个内膜细胞器都可能参与一组不同的离子通道机制，用于细胞器内外的信号转导。
Lysosomal components

Settembre, et al. Nat Rev Mol Cell Biol 25, 223–245 (2024).
在介绍溶酶体离子通道之前，先讲一下溶酶体组成和功能。溶酶体膜成分主要包括脂质和膜蛋白。脂质成分主要包括磷脂、甘脂和固醇等，和细胞膜成分类似（应该是有不同的，暂时没查到）。溶酶体膜蛋白通常高度糖基化，这有助于保护溶酶体膜不被溶酶体内的水解酶水解，维持膜的稳定性。溶酶体膜上还存在着多种通道蛋白及一些特殊结构。
酸化（Acidification）：溶酶体通过V-ATPase（Vacuolar ATPase）维持其内部的ph4.5-5的酸性环境，这对于溶酶体内的水解酶的活性至关重要。
信号传导（Signalling）：溶酶体膜上存在多种信号传导蛋白，如Ragulator复合体（RagC/D和RagA/B），它们参与mTORC1信号通路的调控。mTORC1 通过激活生物合成途径和抑制自噬等分解代谢过程来促进细胞生长。
信号/营养感应（Signalling/Nutrient Sensing）：MiT/TFE转录因子参与信号传导和营养感应。

1. SLC38A9 能够感知溶酶体内的氨基酸水平，并通过与 Ragulator-Rag GTPase 复合体的相互作用来调节 mTORC1 的活性。当氨基酸充足时，SLC38A9 与 Ragulator-Rag GTPase 复合体的结合增强，促进 mTORC1 的激活，从而促进细胞的生长和合成代谢。此外，SLC38A9 还可能通过影响 V-ATPase 的活性来调节溶酶体的酸化过程。
2. LYCHOS 是一种胆固醇感应蛋白，它在溶酶体膜上发挥作用。LYCHOS 能够结合胆固醇，并在胆固醇水平充足时，通过与 GATOR1 复合体的相互作用，促进 mTORC1 的招募和激活，从而推动细胞生长。LYCHOS 通过其 N 端与胆固醇结合，并通过一个细胞质内的环状结构与 GATOR1 相互作用，抑制 GATOR1 对 Rag GTPases 的 GAP 活性，进而解除对 mTORC1 活性的抑制。此外，Niemann-Pick C1 (NPC1) 通过其将胆固醇从溶酶体限制膜中输出的能力，作为该途径活性的负调节因子。
   水解酶（Hydrolases）：溶酶体内含有大约60种水解酶，这些酶在酸性pH下工作，负责溶酶体的降解能力。此外，还有辅助因子如saposins和granulins参与大分子的分解。
   溶酶体中含有多种水解酶，这些酶在酸性环境中发挥作用，负责分解各种生物大分子。以下是一些主要的溶酶体水解酶.
3. 蛋白酶（Proteases）：如组织蛋白酶（Cathepsins）最适ph是5.5（可能的解释：不同溶酶体可能有不同的pH值以适应其内部水解酶的活性需求。）
4. 脂酶（Lipases）：如酸性磷脂酶（Acid phosphatase），负责分解脂质。
5. 核酸酶（Nucleases）：如核糖核酸酶（RNAses）和脱氧核糖核酸酶（DNAses），负责分解核酸。
6. 糖苷酶（Glycosidases）：如β-葡萄糖苷酶（Beta-glucosidase），负责分解糖类。
7. 硫酸酯酶（Sulfatases）：负责分解硫酸酯。
8. 磷脂酶（Phospholipases）：负责分解磷脂。
9. 芳基硫酸酯酶A（Arylsulfatase A）：与黏多糖贮积症相关。
10. α-半乳糖苷酶（Alpha-galactosidase A）：与法布里病（Fabry disease）相关。
11. β-半乳糖苷酶（Beta-galactosidase）：与GM1神经节苷脂病相关。
12. 神经氨酸酶（Sialidase）：负责分解糖蛋白中的N-乙酰神经氨酸。
    这些水解酶在溶酶体的酸性环境中被激活，并通过M6P受体介导的途径被运输到溶酶体中。溶酶体水解酶的异常与多种遗传性疾病有关，这些疾病通常表现为贮积症，其中未被分解的物质在细胞内积累。
    细胞器间的接触和定位（Inter-organelle Contacts and Positioning）是细胞内膜系统的重要组成部分，它涉及到细胞器之间的物理接触和相互作用，这些接触点被称为膜接触位点（Membrane Contact Sites, MCSs）。这些接触位点允许细胞器之间交换物质、信号和能量，从而协调细胞内的各种生理过程。
13. BORC：BLOC1-Related Complex，参与细胞器的定位和运输。
14. ORPs：Oxysterol-Binding Proteins，参与脂质在细胞器间的转移。
15. VPS13C：VPS13C蛋白，与脂质转移蛋白一起介导细胞器间的脂质转移。
16. HOPS complex：Homotypic Fusion and Vacuole Protein Sorting complex，与Rab7 GTPase合作，确保有效的对接和与入胞囊泡载体的融合，并介导与其他细胞器的接触。
17. SNAREs：可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感融合蛋白受体，如VAMP7/8，参与细胞器间的融合过程。
18. Tethers：系绳蛋白，如VPS13C，它们在细胞器间形成物理连接，帮助稳定细胞器的位置并促进物质交换。
    在溶酶体膜上，存在一些关键的蛋白质和酶，它们对于维持溶酶体的功能和身份至关重要。以下是中提到的一些关键组分：
19. Kinases, phosphatases：这些是激酶和磷酸酶，它们通过磷酸化和去磷酸化过程调节蛋白质的活性，从而影响细胞内信号传导和蛋白质功能。
20. FIG4：这是一种磷脂酰肌醇3,5-二磷酸5-磷酸酶，参与调节溶酶体膜的磷脂酰肌醇信号，对溶酶体功能和身份有重要作用。
21. PIKfyve：这是一种磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶，它在磷脂酰肌醇信号传导中发挥作用，影响溶酶体的生物合成和功能。
22. LIMP1/2：Lysosome Integral Membrane Protein 1和2，是溶酶体膜上的整合膜蛋白，参与溶酶体的生物发生和维持溶酶体的身份。
23. LAMP1/2：Lysosome-Associated Membrane Protein 1和2，是溶酶体膜上的糖基化蛋白，它们不仅参与溶酶体的生物发生，还作为溶酶体的标识物。
24. 结构蛋白（Structural Proteins）：高度糖基化的溶酶体相关膜蛋白（LAMPs）和溶酶体整合膜蛋白（LIMPs）形成保护性的糖萼。
    膜通透性（Permeability）：溶酶体膜上的转运蛋白允许各种大分子和微量营养素的交换。这些包括：
    氨基酸、核苷酸、脂质、糖和离子的转运。
    微量营养素如Ca²⁺、H⁺、Na⁺、K⁺、Cl⁻、Fe³⁺/Fe²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺的转运。
    Lysosomal Ion Channels

细胞器腔离子组成在不同的内膜细胞器中差异很大。与细胞质相比，溶酶体腔内的H+、Ca2+、Na+和Cl-含量较高，但K+含量较低。
溶酶体做为酸性细胞器的代表，其腔内酸度[pH ~ 4.5-5.0]是由液泡型(V-)ATP酶建立和维持的，参与H+转运的其他通道有CLCN7，质子泄露通道TMEM175等。
溶酶体内钙离子浓度在0.5mM左右，约是胞质的5000倍。参与Ca调控的通道有TRPMLs, TPCs, P2X4，不过溶酶体Ca2+梯度（50 – 5000倍）比较大，被认为是由一种未知的Ca2+摄取通道/转运体建立的，其中ATP13A2或TMEM165是被提议的候选人。
Na、K相关通道有TRPMLs（一类瞬态受体电位蛋白家族中的粘蛋白亚族离子通道）、TPCs、TMEM175、Lyso-BK。内溶酶体 Na 和 K 电导有助于设置内体和溶酶体的膜电位。
Cl-离子相关通道有CLCN7, Lyso-VRAC, CLN7，这有助于平衡电荷，防止进一步质子泵送的正电位积累.
除了丰富的离子外，溶酶体的管腔中还存在微量金属离子。如 铁3+/铁2+/锌2+，并且存在各种 Fe2+/锌2+溶酶体中的离子通道和转运蛋白。
在接下来的内容中，会重点介绍TRPML1、TPC、Lyso-VRAC、TMEM175。
Methods to study endomembrane ion channels
Patch-Clamp

Chen, C. C., et al. (2017). Nature protocols, 12(8), 1639–1658.
膜片钳技术是一种用于记录通过离子通道的离子电流，以反映细胞膜上单一或多个离子通道分子活动的微电极技术。
原理：使用一个一头尖一头粗的锥状玻璃管，管中设有微电极，管的尖端直径约1.5~3.0um，通过负压吸引使尖端口与细胞膜形成千兆欧姆级的阻抗封接（此时通过微电极的电流几乎为零，电极与细胞膜之间的分流电流达到最小，横跨膜片的电流可以100%作为来自膜片电极的记录电流而被测量出来。），尖端口内的细胞膜区域与周围其他区域形成了电学分隔，然后人工钳制此片区域细胞膜的电位，即可达到对膜片上离子通道电流的监测与记录。
a: 每条线代表在特定膜电位（Y轴，单位为毫伏，mV）下的电流记录。电流的幅度（Y轴，单位为皮安，pA）显示了在不同电位下通过膜的离子流量。
b: 电流-电压关系, 在不同膜电位下，TRPML1通道的电流变化。
Whole-Endolysosome Patch Clamp

溶酶体膜片钳技术。先利用物理、化学方法将溶酶体胀大，然后再将细胞膜戳破，并挤出溶酶体，在溶酶体膜上插上膜片钳测量其电流。参考：Chen, C. C., et al. (2017). Nature protocols, 12(8), 1639–1658.
Other
平面脂双层（Planar Lipid Bilayer）：是一种模拟生物膜的人工膜系统，用于研究膜蛋白质和脂质的行为以及它们在生物膜中的功能。PLB实验的优势在于其能够监测和量化跨膜通道的离子运输，提供对离子导通和通道活动的深入理解。
细胞器离子成像：使用离子敏感荧光基团和基于基因编码的蛋白质离子指示剂进行成像。
TRPML1 Channel (MOCOLN1)

TRPML1（瞬时受体电位粘脂蛋白1，又名MCOLN1）是主要的Ca2+可渗透通道。TRPML1 主要定位于Late endosome and lysosome (LEL) 中。同时，TRPML1 可渗透钠+、钾+、铁2+和 Zn2+。
在内体/自噬体的融合和裂变中，TRPML1受到磷酸肌醇等物质的刺激后，会介导 Ca2+的释放和重金属 Fe2+/锌2+离子从 LEL 腔进入胞质，激活 CaM（钙调蛋白） 促进溶酶体裂变。并进一步促进自噬体/溶酶体的融合。（意义：TRPML1的激活可以促进自噬体与溶酶体的融合，从而介导脑源性神经营养因子（BDNF）的核易位，阻止阿尔茨海默病样表型的轴突营养不良。）
当溶酶体受到渗透性或化学性损伤时，会触发溶酶体膜修复反应。 溶酶体损伤后，TRPML1被激活，通过释放Ca²⁺来促进PI4K2A（磷脂酰肌醇4-激酶2型α）的招募，从而增加PI4P（磷脂酰肌醇-4-磷酸）的产生，进而促进膜修复。同时，TRPML1 介导的 Ca2+ 释放可以将 ESCRT 蛋白（转运必需内体分选复合物）募集到溶酶体，增强其弹性并在压力下维持溶酶体的完整性。
溶酶体与质膜的融合（溶酶体胞吐作用），是一种 Ca2+依赖进程。Syt VII 定位于溶酶体和一些非突触分泌颗粒，介导 Ca2+触发的胞吐作用。它通常不存在于突触小泡上，但在溶酶体内容物的胞吐作用和质膜修复中发挥作用。
钙2+已知可促进和稳定细胞器之间 MCS 形成。TRPML1 介导钙离子的释放促进线粒体-溶酶体接触位点的形成，并有助于钙转移到线粒体中。钙 （Ca2+） 是一种已被证明既可以调节各种细胞类型中的线粒体裂变又可以刺激参与 ATP 生成的线粒体酶的信号。对于维持线粒体功能和能量产生至关重要。 TRPML1 的基因缺失（定位于 NK 细胞中的溶酶体）导致线粒体断裂，并有线粒体嵴塌陷的证据。TRPML1-/-NK92 （NK92ML1-/-） 显示线粒体膜电位丧失、活性氧应激增加、ATP 产生减少和呼吸能力受损。有助于 Ca2+从溶酶体转移到线粒体。
在营养匮乏或氧化应激条件下（如活性氧 （ROS）），使得TRPML1 激活，介导的钙释放激活 CaMKKβ/VPS34 通路，促进自噬体在细胞质中的生物发生。同时，TRPML1 介导的钙释放激活钙调磷酸酶，钙调磷酸酶使 TFEB（转录因子） 去磷酸化，导致其核易位.一旦进入细胞核，TFEB 就会上调参与自噬和溶酶体生物发生的基因的表达，这有助于通过促进自噬来减轻氧化应激。
TRPML1还能介导Ca释放促进溶酶体的运动，参与自噬体融合及溶酶体重塑。（ALG-2 是一种含 EF 手的蛋白，用作溶酶体 Ca²⁺ 传感器，它与动力蛋白-动力蛋白运动复合物相互作用，促进溶酶体沿微管运动。这种运动对于与自噬体的融合和随后的降解过程至关重要）。
总结：TRPML1在内体/溶酶体中主要通过介导Ca离子发挥了广泛的作用，包括自噬体的形成、溶酶体的生物发生、溶酶体重塑，并且在溶酶体膜修复方面也发挥了关键作用。
two-pore channels (TPCs)

Cang, C., et al. (2013). Cell, 152(4), 778–790.
双孔通道 （TPC） 是位于内体和溶酶体膜中的离子通道。溶酶体腔是一个高钠和Ca2+的腔室。TPCs是高度Na选择性通道（哺乳动物中 TPC 的主要类型是 TPC1 和 TPC2），它们参与各种细胞过程，包括膜运输和病毒感染。
TPC 可被第二信使烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸 （NAADP） 和脂质磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸 （PI（3,5）P2） 以及电压变化激活。
Na⁺ 通过 TPC 外流，伴随着 Cl⁻ 和水，导致巨噬体萎缩（巨胞饮作用是细胞吞噬大量细胞外液的过程，巨噬体是在巨胞饮作用过程中形成的大液泡。）。这种收缩导致管化，这被稳定和拉长小管的曲率感应蛋白识别，促进巨噬体的消退。巨胞饮作用是肿瘤细胞的关键生存机制（可促进细胞外液和营养物质的吸收）。
此外，TPC通道中含有哺乳动物雷帕霉素靶标 （mTOR），是ATP敏感通道。 营养丰富的细胞具有高 [ATP]，这可能使 mTOR 能够磷酸化 TPC 和/或其相关蛋白并将通道维持在关闭状态。在细胞饥饿期间，ATP 水平下降，mTOR 从 TPC 脱位，而 lysoNaATP的打开，允许 Na 和其他离子离开溶酶体。同时也会有氨基酸（主要是碱性氨基酸赖：赖氨酸和精氨酸）等物质从溶酶体内流出，以响应饥饿。具体机制不明（我们不知道该通道如何影响溶酶体对蛋白质降解、能量产生、质膜修复和胞吐作用等功能的调节，以维持细胞活力。）
★
从进化的角度看，在自然环境中，动物的生存取决于3种能力（它处理压力的能力，保持寻找食物的能力，以及即使在频繁饥饿的情况下也能抵御入侵者的攻击的能力）。TPC 在空腹耐力中的保持溶酶体功能可能达到了这一目的。
Lyso-VRAC Volume-regulated anion channels (VRACs)

Betapudi V, Egelhoff TT. Traffic. 2009 Dec;10(12):1773-84.
Volume-regulated anion channels (VRACs) 体积调节阴离子通道（VRAC）在调节细胞体积减少（RVD）中发挥关键作用（渗透通道），作为对低渗胁迫的适应性反应，通过介导Cl -、有机渗透物和水的外排。
A：低离子强度（Γ）在野生型（WT）和LRRC8A敲除（KO）细胞中激活整个晚期内核体和溶酶体（LEL） Cl−电流（Lyso-VRAC）。
B：一个说明溶酶体和Lyso-VRAC在低渗应激下细胞渗透调节中的作用的工作模型。低渗环境导致水涌入降低细胞质的渗透压，而降低的细胞质渗透压和离子强度激活了Lyso-VRAC。使溶酶体空泡化（渗透耦合的水通量进入溶酶体腔），以产生大容量的细胞内腔室来储存多余的水。充满水的溶酶体液泡的胞吐作用，即溶酶体胞吐作用，不仅将多余的水挤压到细胞外空间，而且通过将胞内膜传递到质膜，减少了质膜的张力。Lyso-VRAC还存在细胞膜上，可介导cl离子外排，降低细胞渗透压，促进水的外排。
在缺乏Lyso-VRAC的细胞中，溶酶体空泡化被阻断，由于调节性胞质体积减少(胞质RVD；细胞死亡。
Lyso-VRAC 对于细胞对各种应激源的反应至关重要，包括低渗、低氧和低温条件。Lyso-VRAC 电流的缺失增加了持续应激下坏死细胞死亡的程度。 对于单细胞原生生物（如社会变形虫）的收缩液泡，已经描述了类似活性的水挤压机制。
★
从生物进化的角度来看，溶酶体的这种功能可能为细胞提供了一种适应多变环境的机制，这种机制的存在，增强了生物体对环境变化的适应能力，对于生物的生存和繁衍具有重要意义。
TMEM175

TMEM175 是一种普遍表达的 LEL 定位阳离子通道，但在早期内体中也可以检测到少量的 TMEM175。TMEM175 是一种溶酶体钾 （K⁺） 和质子 （H⁺） 通道。然而，在大多数细胞中，TMEM175依赖性基础溶酶体 K 电流非常小，并且在大多数分离的溶酶体中无法检测到。
TMEM175参与溶酶体pH调节。溶酶体pH在4.5-5.0范围内波动，这是大多数溶酶体酶达到最佳水解活性所必需的。对于单个溶酶体，腔内pH是由液泡型（V-） atp酶介导的质子内流（随着腔内酸化而减少）与TMEM175介导的质子外排（随着腔内酸化而急剧增加）的相对速率决定的。对于一个典型的溶酶体，稳态pH值为4.6（设定点），需要一个小的TMEM175 H电流来平衡v – ATP酶介导的质子内流。当ph大于4.6时，TMEM175的H电流会减小，防止溶酶体碱化；当ph小于4.6时，TMEM175活性增加，介导更多的H流出，通过负反馈调节机制防止进一步酸化。
正常情况下，溶酶体内H内流和外派保持平衡，溶酶体发挥正常的物质降解功能。
当TMEM175 基因的变异(TMEM175 缺乏)，例如 M393T 变异，与 PD 风险增加有关。导致溶酶体 pH 下降、自噬清除率降低和磷酸化 α-突触核蛋白积累增加，这是 PD 病理学的标志。
当TMEM175过度活化时（如ArA、DCPIB刺激），会导致稳态设定点ph的短暂碱性转移。
多不饱和脂质花生四烯酸 （ArA） 可以激活整个 LEL TMEM175 H 电流。
DCPIB 是一种广泛使用的 VRAC 阻断剂，被发现在过表达和内源系统中是 TMEM175 H 和 K 电流的激活剂。
P2X4
P2X4 受体不仅存在于质膜上，而且主要位于溶酶体和其他酸性细胞器中，P2X4受体优先定位于溶酶体，并且通过其糖基化保护免受蛋白水解。在溶酶体中，由于低pH值，高浓度的ATP不会触发P2X4受体的激活。只有当pH值增加到7.4时，P2X4受体才能被溶酶体内的ATP激活。被 ATP 激活后，P2X4 受体起到阳离子通道的作用，允许离子（如 Ca2+）通过P2X4 受体的激活会触发溶酶体融合和向细胞外围的重新分布，表明在溶酶体膜运输中发挥作用。
SUMMARY AND FUTURE DIRECTIONS
膜细胞器通道在细胞的生命交响曲中扮演着指挥家的角色，它们在信号转导、生物大分子的合成与降解、物质跨膜运输以及维持细胞器内环境稳态中发挥着至关重要的作用。尽管我们已经在这一领域取得了显著进展，但仍有许多内源性细胞器通道的神秘面纱尚未揭开。
至今，科学家们已经鉴定并表征了约24种膜细胞器通道，它们中的许多展现出独特的细胞器电生理特性。特别是内质网和溶酶体通道，如IP3Rs和TRPML，已成为研究的热点。随着创新的通道检测技术的发展，我们开始揭示这些通道的内源性激动剂和小分子调节剂，为细胞信号传导的研究提供了新的视角。
药理学工具和遗传模型的应用，已经为我们理解一些已知膜通道的细胞器功能提供了线索。然而，这些通道如何响应环境变化和细胞信号的复杂调控，仍是一个充满未知的领域。为了深入探索这些通道的奥秘，我们需要高分辨率的实时成像技术，以监测在不同生理状态下细胞器的动态变化，以及膜通道活性的即时调节。
虽然分子表达分析和脂质双分子层研究为我们提供了一些候选通道的线索，但大多数细胞器通道的探索仍需依赖于细胞器膜片钳技术和细胞器离子成像技术。未来，我们期待更多分子通道的发现，以及它们的化学激动剂和抑制剂的开发。这些工具与基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）的结合，将有助于我们精确地描绘每个细胞器通道的生理功能。
细胞器通道的调控机制复杂，通常涉及多个细胞信号通路。因此，利用位点特异性突变敲入模型进行研究，将有助于我们精确理解每个激活信号的具体功能。此外，膜通道在治疗领域的潜力已经得到初步验证。特别是，增强溶酶体运输可能为多种遗传性疾病和神经退行性疾病提供新的治疗策略。
随着研究的深入，内溶酶体通道或许能成为连接多种疾病的共同治疗靶点。这一概念的探索，需要更多体外细胞实验和体内动物模型的研究来支持。在未来的科学旅程中，膜细胞器通道的研究将继续拓展我们对细胞内部世界的理解，为人类健康带来新的希望。
呼! 忙忙碌碌一整年，做实验的时间过得太快了，一眨眼就到年底了。